Hydroksyzyna jako potencjalny lek w zespole Smith-Lemli-Opitz (SLOS)

Czy rozumiemy patomechanizmy SLOS?

Zespół Smith–Lemli–Opitz (SLOS) jest złożonym zaburzeniem rozwojowym i intelektualnym wynikającym z patogennych wariantów w genie reduktazy 7-dehydrocholesterolu (DHCR7). Genetyczne zahamowanie genu DHCR7 zmniejsza konwersję 7-dehydrocholesterolu (7-DHC) do cholesterolu, co prowadzi do akumulacji 7-DHC praktycznie we wszystkich komórkach organizmu, w tym w mózgu. Ponieważ 7-DHC jest najbardziej podatnym na utlenianie lipidem znanym do tej pory, przyczynia się do powstawania licznych oksysteroli pochodnych 7-DHC, które są toksyczne dla rozwijających się komórek. Fenotyp SLOS wynika więc z dwóch jednoczesnych niekorzystnych procesów molekularnych podczas rozwoju: obniżonego poziomu cholesterolu i zwiększonego poziomu 7-DHC (z odpowiednim wzrostem oksysteroli pochodnych 7-DHC).

Szlak syntezy cholesterolu jest zachowany wśród gatunków ssaków, obejmuje ponad 30 dedykowanych enzymów i dostarcza substraty dla wielu komórkowych szlaków metabolicznych. Po syntezie lanosterolu, biosynteza cholesterolu przebiega poprzez dwie oddzielne, ale interaktywne gałęzie zwane gałęziami Kandutsch-Russell i Blocha. Wykorzystanie tych gałęzi zależy od typu komórki. Endogenna synteza steroli w rozwijającym się mózgu jest złożona, gdzie zarówno neurony, jak i komórki glejowe preferencyjnie wykorzystują szlak biosyntezy Blocha, z DES będącym bezpośrednim prekursorem CHOL. W SLOS, inhibicja DHCR7 wpływa zarówno na gałęzie Blocha, jak i Kandutsch-Russel, prowadząc do zwiększenia poziomów 7-DHC, 7-DHD i 8-DHC oraz zmniejszenia poziomów desmosterolu i cholesterolu. Z tego powodu kompleksowa analiza pośrednich produktów po lanosterolu jest niezbędna do pełnej oceny złożoności fenotypu SLOS.

Aktualnie nie istnieje skuteczna metoda leczenia SLOS. Terapie oparte na wiedzy, takie jak suplementacja cholesterolem w diecie, okazały się mniej skuteczne niż oczekiwano. Pule cholesterolu w organizmie i mózgu są oddzielone barierą krew-mózg, a mózg syntetyzuje własny cholesterol, dlatego suplementacja cholesterolem w diecie nie ma korzystnego wpływu na rozwijający się mózg. W związku z tym kontynuowane są poszukiwania skutecznych metod leczenia, ze szczególnym uwzględnieniem przeciwdziałania toksycznym efektom 7-DHC.

Czy hydroksyzyna może zmienić leczenie SLOS?

Jednym z obiecujących kierunków była analiza zatwierdzonych leków pod kątem ich zdolności do obniżania poziomu 7-DHC. W niedawnym badaniu wykorzystującym bibliotekę NIH Clinical Collection, spośród 727 leków zatwierdzonych do stosowania u ludzi, ponad 30 związków zmniejszało poziom 7-DHC w komórkach Neuro2a z deficytem Dhcr7. Na podstawie wielkości redukcji poziomu 7-DHC i mechanizmu działania, badanie przesiewowe zidentyfikowało hydroksyzynę (HYZ) jako jednego z głównych kandydatów do potencjalnego leczenia SLOS.

Hydroksyzyna jest lekiem przeciwhistaminowym o wielu wskazaniach do stosowania u dorosłych i dzieci. Wskazania te obejmują świąd spowodowany alergicznymi reakcjami skórnymi, złagodzenie lęku i napięcia oraz stosowanie jako środek uspokajający przed i po znieczuleniu ogólnym. Jest przede wszystkim silnym blokerem receptora H1, z ponad 50-letnią historią stosowania klinicznego zatwierdzonego przez FDA. HYZ jest generalnie uważana za dobrze tolerowany i bezpieczny lek, o czasie półtrwania około 20 godzin, metabolizowany w wątrobie przez CYP3A4 i CYP3A5.

W opisywanym badaniu sprawdzano, czy HYZ może być potencjalnie wykorzystana jako leczenie oparte na wiedzy dla pacjentów z SLOS. Postawiono hipotezę, że może ona obniżyć wysokie poziomy 7-DHC obserwowane w modelach SLOS i znormalizować profil biochemiczny po lanosterolu. Wykorzystano analizy LC-MS/MS poziomów pośrednich po lanosterolu, aby przetestować wpływ HYZ na charakterystyczne cechy biochemiczne SLOS. Analizy przeprowadzono na czterech różnych modelach SLOS: komórkach Neuro2a z deficytem Dhcr7, kulturach neuronalnych i glejowych z myszy transgenicznych Dhcr7^T93M/T93M (zwalidowany transgeniczny model myszy SLOS) oraz ludzkich fibroblastach skórnych od pacjentów z SLOS.

Jakie metody zastosowano w badaniach laboratoryjnych?

W badaniu wykorzystano różne materiały i metody. Wszystkie odczynniki chemiczne, o ile nie zaznaczono inaczej, pochodziły od Sigma-Aldrich Co. Rozpuszczalniki o jakości HPLC uzyskano od Thermo Fisher Scientific Inc. Hydroksyzynę zakupiono od Selleck Chemicals. Źródła standardów sterolowych (zarówno naturalnych, jak i znakowanych izotopowo) pochodziły od Kerafast, Inc.

Komórki Neuro2a uzyskano z ATCC. Komórki Neuro2a z deficytem Dhcr7, wygenerowane przez stabilną transfekcję Dhrc7-shRNA, zostały wcześniej szeroko zwalidowane. Hodowano je w EMEM uzupełnionym L-glutaminą (2 mM) i 10% FBS w temperaturze 37°C i 5% CO₂. Komórki poddawano subkulturze raz w tygodniu, zmieniając medium co 2 dni. Do eksperymentów komórki wysiewano na płytki 96-dołkowe, zarówno do oceny żywotności komórek, jak i analizy steroli. Do oceny endogennej syntezy steroli hodowano kultury w zdefiniowanym medium bez cholesterolu i bez lipidów. Na końcu inkubacji używano barwnika Hoechst we wszystkich dołkach do liczenia całkowitej liczby komórek przy użyciu ImageXpress Pico i pakietu oprogramowania CellReporterXpress.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez UNMC IACUC Review Board i przeprowadzone zgodnie z ustalonymi standardami dobrostanu zwierząt. Myszy Dhcr7^T93M/T93M były uprzejmością FD Porter, NIH, Bethesda, MD. Te myszy mają patogenny wariant w obu allelach Dhcr7 w c.278C>T odpowiadający ludzkiej mutacji missense T93M. Co ważne, ten patogenny wariant genu Dhcr7 jest najczęstszym wariantem missense opisanym u pacjentów z SLOS. Pierwotne korowe hodowle neuronalne uzyskano z myszy Dhcr7^T93M/T93M E18 zgodnie z wcześniejszym opisem. Dla hodowli glejowych wykorzystano to samo źródło komórek co dla hodowli neuronalnych, stosując specyficzne procedury hodowlane.

Hodowle fibroblastów również opisano w poprzedniej publikacji. Wszystkie hodowle fibroblastów używane do eksperymentów były między pasażami 8 a 15. Wszystkie komórki utrzymywano w DMEM zawierającym 25 mM glukozy i 1 mM pirogronianu sodu uzupełnionym 2 mM L-glutaminą, 10% FBS i 50 U/mL antybiotyku w temperaturze 37°C i 5% CO₂. Dla ekspozycji na hydroksyzynę (jedna dawka co 48 godzin), komórki hodowano w DMEM z 10% delipidowanym FBS na płytkach 96-dołkowych przez 6 dni.

Ekstrakcje steroli przeprowadzano przez dodanie mieszaniny standardów steroli i MeOH do każdej z płytek 96-dołkowych. Przygotowano roztwór zapasowy deuterowanych standardów zawierający różne stężenia związków w MeOH. Roztwór zapasowy standardów zawierał 1% (v/v) Et₃N i mieszaninę przeciwutleniaczy, aby zapobiec izomeryzacji i/lub utlenianiu. Analizę próbek przeprowadzono na systemie Acquity UPLC wyposażonym w uchwyt na płytki zgodny z ANSI. Sterole analizowano na Agilent Poroshell EC-C18 z fazą ruchomą CH₃CN:MeOH:H₂O, 70:25:5 (0,01% (v) kwasu mrówkowego, 1 mM NH₄OAc) w temperaturze kolumny 40°C. Do detekcji MS używano tandemowego spektrometru masowego TSQ Quantum, a dane zbierano za pomocą pakietu oprogramowania Xcalibur.

Analizy statystyczne przeprowadzono i wizualizowano przy użyciu pakietu oprogramowania Graphpad Prism 10 dla Windows. Przeprowadzono nieparowane dwustronne testy t dla indywidualnych porównań między dwiema grupami. Stosowano korekcję Welcha, gdy wariancja między dwiema grupami była znacząco różna.

Jakie efekty HYZ ujawniają badania in vitro?

Wyniki badania wykazały, że w komórkach Neuro2a z deficytem Dhcr7 HYZ powodowała zależne od dawki zmniejszenie poziomu 7-DHC o nawet 75% (z 2,2 do 0,52 nmol/milion komórek) i 8-DHC o nawet 55% (z 1,9 do 0,8 nmol/milion komórek). Poziomy desmosterolu (DES) wykazały niewielki wzrost o około 5-10%, podczas gdy poziomy cholesterolu (CHOL) pozostały praktycznie niezmienione, nawet gdy komórki Neuro2a z deficytem Dhcr7 były eksponowane na najwyższe stężenie HYZ.

W kontrolnych komórkach Neuro2a, analizy LC-MS/MS ujawniły zależny od dawki wzrost 8-DHC o nawet 300% przy najwyższej testowanej dawce HYZ, w połączeniu ze spadkiem DES o 20%. Poziomy CHOL były tylko nieznacznie dotknięte i tylko przy najwyższej dawce HYZ (10% spadek). W genetycznie niemodyfikowanych komórkach Neuro2a, 7-DHC wzrósł o >400%.

W neuronach embrionalnych Dhcr7^T93M/T93M, HYZ wykazała silny wpływ na biosyntezę po lanosterolu. Obserwowane zmiany były zależne od dawki i obejmowały większość badanych analitów. Przy najwyższym stężeniu, ekspozycja na HYZ prowadziła do zwiększenia poziomów lanosterolu (LAN) (262%), zymosterolu (ZYM) (496%), 8-DHC (311%) i 8-dehydrodesmosterolu (8-DHD) (236%). Natomiast przy najwyższym stężeniu, HYZ obniżała poziomy 7-DHC (84%), 7-DHD (78%), DES (60%) i zymostenolu (ZYME) (29%). Poziomy CHOL nieznacznie się zmniejszyły (25%), podczas gdy poziomy latysterolu (LATH) i dehydrolatysterolu (DHL) pozostały niezmienione.

W komórkach glejowych najwyższe stężenie HYZ powodowało zwiększenie poziomów ZYM (1249%), ZYME (5000%), 8-DHC (315%) i 8-DHD (290%). Natomiast przy najwyższym stężeniu, HYZ obniżała poziomy 7-DHC (63%), 7-DHD (42%) i DES (30%). Poziomy CHOL nieznacznie się zmniejszyły (6%). Najważniejszą różnicą w odpowiedzi na HYZ między kulturami neuronalnymi a glejowymi był poziom ZYME, który wykazywał spadek w kulturach neuronalnych i silny, zależny od dawki wzrost w kulturach glejowych. Może to odzwierciedlać różnice w wykorzystaniu szlaku sterolowego w neuronach i astrocytach.

Kontrolne fibroblasty skórne miały ogólnie niższe poziomy bazowe 7-DHC, 8-DHC, DHL i 7-DHD w porównaniu do fibroblastów pochodzących od pacjentów z SLOS. Spośród nich najbardziej wyraźne różnice bez leczenia obserwowano dla 7-DHC, następnie 7-DHD i DHL. Bazowe poziomy DES były zmniejszone w fibroblastach od pacjentów z SLOS, podczas gdy bazowe poziomy CHOL wykazywały zmienność we wszystkich fibroblastach (niezależnie od statusu choroby) w nieleczonych kulturach. HYZ zmieniała profil steroli w kontrolnych fibroblastach w sposób zależny od dawki. Jednak warto zauważyć, że poziomy tych pośrednich steroli były bardzo niskie.

Fibroblasty pochodzące od pacjentów z SLOS wykazywały jeszcze bardziej wyraźną zmianę profilu biochemicznego po lanosterolu w odpowiedzi na HYZ. 7-DHC, DHL i 7-DHD były zmniejszone, podczas gdy ZYM, ZYME i 8-DHC były zwiększone. Co istotne, leczenie nie miało zauważalnego wpływu na ogólne poziomy CHOL.

Czy HYZ działa jako unikalny modulator biosyntezy steroli?

Podsumowując, we wszystkich czterech modelach in vitro SLOS, najbardziej spójnymi wynikami były silne i statystycznie istotne spadki poziomów 7-DHC i 7-DHD oraz zwiększone poziomy ZYM. Inne pośrednie sterole, choć wyraźnie zmienione w jednym lub dwóch modelach SLOS w wyniku leczenia HYZ, wykazywały rozbieżny kierunek zmian. Podkreśla to znaczenie uzyskiwania zbieżnych danych i unikania ekstrapolacji wniosków na podstawie pojedynczego modelu in vitro.

Wiele leków na receptę ma efekt modulujący biosyntezę po lanosterolu. Te efekty koncentrowały się głównie na inhibicji DHCR7 w kontekście zmian poziomów 7-DHC i cholesterolu. Wcześniejsze badania opisywały efekty inhibicyjne DHCR7 aripiprazolu, haloperidolu, sertraliny, kariprazyny i trazodonu. Jednak efekty HYZ na biosyntezę steroli są znacznie bardziej złożone i są wyraźnie zapośredniczone przez inny mechanizm molekularny.

Wyniki badania pokazują, że HYZ jest silnym modulatorem biosyntezy po lanosterolu. W kontrolnych komórkach Neuro2a, leczenie HYZ skutkowało zmienionymi poziomami pośrednich steroli po lanosterolu. To odkrycie jest już godne uwagi, ponieważ efekt modulujący biosyntezę steroli HYZ nie został do tej pory scharakteryzowany. Znając kruchy homeostazę równowagę pośrednich steroli i zasadniczą rolę cholesterolu podczas rozwoju, jest to odkrycie, którego nie należy przeoczać. Co ciekawe, rozbieżna odpowiedź biochemiczna na HYZ między genetycznie niemodyfikowanymi a komórkami Dhcr7^−/− w poziomach 7-DHC, 8-DHC i DES jest zaskakująca i pozostaje niewyjaśniona w obecnym czasie. Autorzy badania stawiają hipotezę, że HYZ może działać jako “wyrównywacz biosyntezy” po lanosterolu, zmniejszając zwiększone poziomy prekursorów steroli i zwiększając niskie poziomy prekursorów. Może to być zapośredniczone przez jeszcze nieznany biochemiczny mechanizm sprzężenia zwrotnego, albo poprzez mechanizm zależny od receptora, albo bezpośrednie działania na enzymy biosyntezy.

Jakie perspektywy i zagrożenia niesie HYZ?

Wcześniejsze badania wykazały, że osoby DHCR7^+/−, stanowiące około 3% populacji ludzkiej, mogą być szczególnie podatne na zmiany w biosyntezie steroli, gdy są narażone na leki o działaniach ubocznych hamujących sterole. Na tej podstawie HYZ powinna być potencjalnie unikana u zdrowych matek DHCR7^+/− podczas ciąży, ponieważ mogą one nosić dziecko o podobnym genotypie, potencjalnie prowadząc do skumulowanego ryzyka niekorzystnych skutków.

Jednak w przeciwieństwie do wszystkich wcześniejszych badań leków zmieniających biosyntezę steroli, HYZ ma nietypowe efekty. Mianowicie, obserwowane różnice w profilu biochemicznym po lanosterolu zmienionym przez HYZ między komórkami Neuro2a z deficytem Dhcr7, neuronami i komórkami glejowymi myszy Dhcr7^T93M/T93M oraz ludzkimi fibroblastami skórnymi od pacjentów z SLOS są zaskakujące, ponieważ wszystkie cztery z tych systemów in vitro używają tej samej maszynerii biosyntezy steroli. W szczególności, spadek 8-DHC w leczonych HYZ komórkach Neuro2a z deficytem Dhcr7 i wzrost 8-DHC w trzech innych modelach SLOS sugeruje inny, jeszcze nieznany system modulujący.

Na poziomie molekularnym, wyjaśnieniem złożonego profilu zmian biosyntezy po lanosterolu jest potencjalne (bezpośrednie lub pośrednie) zahamowanie EBP obserwowane w neuronach Dhcr7^T93M/T93M, komórkach glejowych i ludzkich fibroblastach skórnych od pacjentów z SLOS. Przy zahamowaniu EBP, jego substraty ZYM i ZYME gromadzałyby się, a wyższe poziomy ZYME prowadziłyby również do podwyższonych poziomów 8-DHC. W konsekwencji, poziomy DHL, 7-DHD i 7-DHC byłyby obniżone. Jednak to zahamowanie EBP (lub potencjalnie obniżone poziomy ekspresji EBP) przez HYZ musiałoby zostać przetestowane w przyszłych eksperymentach kontynuacyjnych, wykraczających poza zakres obecnych badań.

Ważnym pytaniem, które pojawia się w wyniku tych badań, jest potencjalna korzyść z HYZ dla pacjentów z SLOS. Badania epidemiologiczne wyraźnie wskazują, że inhibitory DHCR7 mogą być uważane za teratogeny. W tym kontekście, redukcja poziomów DHL, 7-DHD i 7-DHC sugerowałaby, że HYZ powinna być rozważana jako potencjalny środek terapeutyczny dla pacjentów z SLOS, ponieważ zmniejszałaby powstawanie toksycznych oksysteroli bez dalszego kompromitowania poziomów cholesterolu. Jednak argument ten jest znacznie osłabiony przez obserwowany wzrost poziomów ZYM, ZYME i 8-DHC w fibroblastach pacjentów z SLOS. Obecnie nasza wiedza na temat oksysteroli, które mogą generować, i ich wpływu na rozwój człowieka i ogólny stan zdrowia jest ograniczona. Co ważne, patogenne warianty w genie EBP, jak stwierdzono, powodują punktową chondrodysplazję sprzężoną z chromosomem X typu 2, niepełnosprawność rozwojową, która podziela niektóre cechy fenotypowe z SLOS. W tym kontekście, jeśli obserwowany profil po lanosterolu jest wynikiem inhibicji EBP, terapeutyczne użycie HYZ u pacjentów z SLOS może nie być idealne.

Ostateczna użyteczność HYZ jako związku terapeutycznego dla pacjentów z SLOS będzie zależeć od złożonego zestawu czynników: dawki, czasu leczenia, korzystnej redukcji poziomów 7-DHC, wielkości potencjalnie szkodliwego wzrostu poziomów 8-DHC, szybkości usuwania pośrednich steroli/oksysteroli i innych zmiennych. Można sobie wyobrazić, że ekspozycja na HYZ podczas rozwoju embrionalnego mogłaby być szkodliwa, ale potencjalnie korzystna na późniejszych etapach życia. Wreszcie, w oparciu o wszystkie te zmienne i rozbieżność danych dotyczących steroli w badanych modelach, czy HYZ może być korzystna dla jednego układu narządów w SLOS, ale szkodliwa dla innego? Te kluczowe pytania będą musiały zostać podjęte w dalszych eksperymentach.

Podsumowanie

Badania nad hydroksyzyną (HYZ) w kontekście leczenia zespołu Smith-Lemli-Opitz (SLOS) wykazały, że lek ten jest silnym modulatorem biosyntezy steroli. W czterech różnych modelach in vitro SLOS zaobserwowano znaczące spadki poziomów 7-DHC i 7-DHD oraz wzrost poziomów zymosterolu. HYZ wykazuje złożony mechanizm działania, odmienny od innych znanych leków wpływających na biosyntezę steroli. Szczególnie istotne jest jej działanie jako “wyrównywacza biosyntezy”, zmniejszającego podwyższone i zwiększającego obniżone poziomy prekursorów steroli. Jednak potencjalne zastosowanie terapeutyczne HYZ wymaga dalszych badań ze względu na rozbieżne efekty w różnych modelach komórkowych oraz możliwe ryzyko związane ze wzrostem poziomów niektórych steroli. Kluczowe znaczenie dla skuteczności terapii będą miały czynniki takie jak dawkowanie, czas leczenia oraz indywidualna odpowiedź organizmu.